Применение генной инженерии животных в сельском хозяйстве: метод секвенирования

-Крупный рогатый скот (КРС) принадлежит к древней группе млекопитающих, Cetartiodactyla, которые впервые появились около 60 миллионов лет назад.

Одомашненный КРС (Bos taurus и Bos taurus indicus) произошел от общего предка 250 000 лет назад. Он имел давнюю и богатую связь с человеческой цивилизацией со времен неолита 8000-10000 лет назад. Все современные породы КРС произошли от больших популяций древних зубров на протяжении тысячелетий одомашнивания. За это время выведено более 800 пород.

Ежегодно в мире выращивается более миллиарда голов КРС для производства говядины и молочных продуктов, шкур. Крупный рогатый скот — стратегически значимый экономический ресурс. У него большой научный потенциал, что способен помочь улучшить понимание современной селекции и генетики.

Геном каждого организма содержит всю его генетическую информацию. Технология секвенирования всего генома позволяет всесторонне и точно анализировать целые ДНК. Расшифровывать содержащуюся в них информацию и раскрывать сложность и разнообразие наследуемых признаков.

Появление технологии полногеномного секвенирования (ПС) — революционное достижение во всех областях наук о жизни. Оно позволяет обнаруживать варианты, включая однонуклеотидные варианты, вставки или делеции, изменения числа копий и крупномасштабные структурные варианты.

ПС можно разделить на de novo и повторное секвенирование в зависимости от того, существует ли эталонный геном. При наличии эталонного сборка генома станет более простой и быстрой.

В начале 80-х годов Сэнгер успешно завершил секвенирование всего генома лямбда-фага с помощью метода дробовика. Метод был успешно применен к ДНК:

ГСеквенирование по методу дробовика — классическая стратегия для секвенирования всего генома. Технология сначала случайным образом разбивает полную последовательность-мишень на небольшие фрагменты, секвенируемые отдельно. Затем объединяет их в согласованную последовательность, используя перекрывающиеся отношения этих небольших фрагментов.

В основном это включает в себя два метода:

ГОднако сборка генома эукариотических организмов затруднена из-за обилия повторяющихся последовательностей. Метода не является точным.

Геном крупного рогатого скота является последним в серии крупномасштабных проектов секвенирования, основанных на традиционных автоматизированных методах Сэнгера.

Если говорить о практическом применении технологий, то секвенирование генома КРС началось в декабре 2003 года под руководством Ричарда Гиббса и Джорджа Вайнстока. Это было в центре секвенирования генома Медицинского колледжа Бейлора в Хьюстоне, штат Техас, США. Первая предварительная последовательность генома крупного рогатого скота основана на ДНК, взятой у герефордской мясной породы скота - L1 Dominette 01449.

Параллельно большое количество однонуклеотидных последовательностей было получено из частичного генома шести пород (голштинской, ангусской, джерсейской, лимузинской, красной датской и брахманской). Вместе с последовательностью L1 Dominette 01449 (эталонный геном КРС) они представляют собой ценный ресурс для маркерного отбора генетических признаков в коммерческих программах селекции.

В отличие от классических подходов, современные платформы секвенирования следующего поколения используют значительно упрощенный метод построения библиотеки данных. Как правило, геномная ДНК сначала случайным образом фрагментируется. Для этого ее обрабатывают ультразвуком или распыления. Затем лигируется с набором двухцепочечных адаптеров, специфичных для конкретного фрагмента.

Впоследствии эти участки ДНК могут быть амплифицированы in situ путем гибридизации и удлинения с помощью комплементарных адаптеров. Они ковалентно прикреплены к поверхности стеклянной микрофлюидной ячейки или небольшого шарика (в зависимости от платформы секвенирования). Во всех современных системах используется микрофлюидное устройство для хранения амплифицированных фрагментов. Затем следует этап визуализации: собираются данные из участков ДНК, подвергающихся активному секвенированию.

Хотя секвенирование следующего поколения позволило проводить популяционный анализ небольших вариантов, трудно выявить более крупные структурные вариации. Кроме того, сборка de novo с использованием секвенирования следующего поколения часто имеет более низкое качество по сравнению с теми, которые используют старые и более дорогие методы.

Технологии одномолекулярного секвенирования позволяют преодолеть эти трудности. А последние могут охватывать почти все ветви хромосом и не чувствительны к содержанию ДНК.

Методы секвенирования третьего поколения разработаны и используются, чтобы получать высокоточные de novo и эталонные сборки микроорганизмов, растений, животных и человека.

Технология генерации необработанных данных о последовательностях ДНК быстро развивалась за последние 35 лет. В самом начале это было секвенирование по Сэнгеру в 1970-х годах. Затем появилось автоматизированное флуоресцентное секвенирование по Сэнгеру в 1980-х.

В последнее время созданы методы со сверхвысокой пропускной способностью. Они основаны на платформах параллельного секвенирования, производимых 454, Illumina и ABI.

Однако масштаб достижений не соответствует новым алгоритмам и инструментам для сборки последовательностей, особенно для больших геномов.

Распространенные проблемы, связанные с большими геномами:

Первые две проблемы могут вызывать ошибки при анализе генома.

Сборка генома по-прежнему остается трудностью. Она требует сочетания параллельных вычислений и напряженной рутинной работы команд специалистов. Необходимо поэтапное изменение алгоритмов и подходов, используемых для анализа последовательности ДНК.

Примечание

В текстах наших статей описание целей, задач, дизайна, результатов иностранных и российских исследований и выводов, сделанных их авторами, является кратким пересказом в нашей интерпретации, который не следует считать исчерпывающей и точной информацией об указанных исследованиях.

Если вас интересуют точная и полная информация об этих исследованиях, следует читать источники по ссылкам, приведенным после статей, где применимо.